RT-PCR (Reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa)

La RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), o reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa, è una tecnica di laboratorio ampiamente utilizzata in biologia molecolare per amplificare e quantificare specifici frammenti di RNA. Essenzialmente, combina la trascrittasi inversa (RT) per convertire l'RNA in DNA complementare (cDNA), seguito dall'amplificazione del cDNA utilizzando la PCR.

Ecco un riassunto degli aspetti chiave:

• Principio: La RT-PCR permette di rilevare e quantificare l'espressione genica misurando i livelli di mRNA.

• Fasi principali:

  1. Trascrizione Inversa: Un enzima chiamato trascrittasi%20inversa converte l'RNA bersaglio in DNA complementare (cDNA).
  2. PCR: Il cDNA viene quindi amplificato usando la PCR. Questo processo ciclico denatura il DNA, appaia i primer (brevi sequenze di DNA che fiancheggiano la regione target) e allunga le copie di DNA utilizzando una DNA polimerasi.

• Tipi di RT-PCR:

  • RT-PCR tradizionale (endpoint RT-PCR): La quantità di prodotto PCR viene misurata solo alla fine della reazione. È meno quantitativa.
  • RT-PCR quantitativa (Real-Time RT-PCR o qRT-PCR): La quantità di DNA amplificato viene misurata in tempo reale durante la reazione PCR. Questo permette una quantificazione precisa dell'RNA di partenza. La qRT-PCR utilizza marcatori fluorescenti per monitorare l'amplificazione del DNA in tempo reale.

• Applicazioni:

  • Diagnosi di malattie infettive: Rilevazione di virus come COVID-19, HIV e influenza.
  • Studi sull'espressione genica: Quantificazione dei livelli di mRNA per comprendere la regolazione genica.
  • Conferma dei risultati di microarray o RNA-seq: Validazione dei dati di espressione genica ottenuti da tecniche ad alto rendimento.
  • Ricerca sul cancro: Identificazione di marcatori tumorali e monitoraggio della risposta alla terapia.
  • Ingegneria genetica: Clonazione di geni da RNA.

• Vantaggi:

  • Elevata sensibilità.
  • Quantificazione precisa dell'RNA.
  • Possibilità di rilevare anche basse quantità di RNA.

• Limitazioni:

  • Rischio di contaminazione.
  • Design dei primer critico per il successo della reazione.
  • Necessità di un'accurata normalizzazione dei dati.